A western blot technika menete

• - A futtatás előtt a vizsgálandó mintákat előkezeljük (detergensek, hődenaturálás, diszulfid-hidak redukálása).

• - A minta fehérjéit a gélen (általában SDS-PAGE (nátrium-dodeciszulfát-poliakrilamid) gél) moláris tömegük alapján elválasztjuk.

• - A futtatás után a gélt nitrocellulóz vagy PVDF (polyvinylidene-fluorid) membránra elektromos áram segítségével blottoljuk.

• - Transzfer után a membránhoz aspecifikusan fehérjéket kötünk, blokkoljuk (pl. 5%-os zsírmentes tejport tartalmazó TBS-Tris puffer vagy PBS-foszfát puffepufferben

• - Ezt követően a vizsgálandó fehérjére jellemző specifikus primer antitestet visszük a membránra. Az antitestek a kötődésük során leszorítják az aspecifikusan kötődő tejfehérjéket azokról a fehérjékről, melyeket specifikusan felismernek.

• - Mosást követően másodlagos az elsődleges antitesteknek megfelelő antitesteket viszünk a membránra. Ezek lehetnek enzimatikusan vagy fluoreszcensen jelölve.

• - A detektálás a másodlagos antitest jelölésétől függően történhet kemilumineszcens, kolorimetrás vagy fluoreszcens módon

• - A vizsgálandó protein mennyisége a kapott jelek denzitásának függvényében számitható ki, kontrollhoz és egy a sejtben állandó mennyiségben jelenlévő háztartási génhez viszonyítottan.

1. ábra: Western blot folyamatábra

2. ábra: Western blot detektálása