 |
XVI./ 3.3.3. Elektroforézis alapú technikák
Az elektroforézis az az elválasztási módszer, amely a töltéssel rendelkező oldott anyag azon képességén alapszik, hogy egy adott vezető képességgel rendelkező közegben elektromos feszültség hatására elmozdul. Ez a vezető képességű közeg nem más, mint egy puffer vizes oldata. Az elektroforetikus elválasztás alapja, hogy a különböző méretű részecskék az elektromos tér hatására különböző sebességgel mozognak. Molekuláris biológiában leginkább a PCR termék ellenőrzésére, valamint a kapott amplikonok meghatározására használjuk, azt használva ki, hogy a negatív töltésű DNS a pozitív töltés felé vándorol.
|
 |
XVI./ 3.3.3.1. Gélelektroforézis
A legegyszerűbb és a legáltalánosabban használt DNS elválasztó módszer az agaróz vagy poliakrilamid gélelektroforézis, amelyek segítségével méret alapján tudunk DNS fragmentumokat szétválasztani. Az elválasztási tartományt a polimerizált szilárd fázis töménységével lehet beállítani és a PCR termék várt hosszának megfelelően tudunk vizsgálni. A DNS-t interkaláló festékkel (pl.: etídium-bromid, SYBR Green) segítségével teszük láthatóvá. Ezek a festékek a DNS kettős szálba épülve UV-fény hatására gerjesztődnek és megjelenítik a terméket.
1. ábra: Gélelektroforézis menete (https://docplayer.hu)
|
2. ábra: Agaróz gélelektroforézis tipikus képe (fotó: SE-GRI)
|
|
|
XVI./ 3.3.3.2. A kapilláris elektroforézis
A kapilláris elektroforézis során az elválasztás egy kis belső átmérőjű (néhány microméter), 20-100 cm hosszú polimerrel töltött kapillárisban történik. Ilyenkor az elektroozmotikus áramlás hatására a folyadék az elektromos tér hatására az elektromosan töltött felület mentén elmozdul. A minta elektroforetikus sebessége függ a futási körülményektől: puffer típusa, pH, hőmérséklet, az elektromos feszültség nagyságától, és a kapillárisban található mátrixtól (polimertől).
2. ábra: kapilláris elektroforézis elve
|
Kapilláris elektroforézis során egy amplifikációs PCR termék elektrokinetikai injektálás hatására a kapillárisba kerülnek. A nagy feszültség hatására a negatívan töltött molekulák a kapillárisba kerülnek és a minták méret szerint elválasztódnak az összfelületi töltésük alapján.
A kapilláris elektroforézis alkalmazásai:
|
 |
Sanger szekvenálás
Szekvenálás alatt azt a folyamatot értjük, amelynek során a DNS pontos nukleotid sorrendjét határozzuk meg. Ennek alapja, hogy a DNS polimeráz a fluoreszcensen jelölt lánc-terminációs didezoxinukleotidokat szelektívan integrálja. Ezeket fragmenseket, a méretük alapján kapilláris elektroforézis segítségével futtatjuk meg.
XVI_3_3_3_2_fejezet_2_abra
Felirat: Egy szekvenogram tipikus képe
|
|
Fragmens analízis
Fragmens analízis alatt genetikai marker analízist értünk, amely egy adott DNS fragmens méretbeli változásának vizsgálatán alapszik. A méretbeli különbségek egy genetikai marker jelenlétére vagy hiányára utal. Fluorescensen jelölt primerek használatával a vizsgálandó DNS fragmenseket jelölni tudjuk, majd ezeket kapilláris gél elektroforézissel választjuk el méretük alapján. Egyszerre több, különböző fluorescens festékkel jelölt primert is használhatunk, és az elektroforézis alatt egy jelült méret standardet is használunk, amely segítségével a különböző fragmensek mérete meghatározható.
4. ábra: Fragmens analizis – a fluoreszcensen jelölt DNS fragmensek méretük alapján elválasztásra kerülnek
|
Fragmens analízis alkalmazásai:
- A mikroszatellita (STR) analízis
Egy nukleotid polimorfizmus (single nucleotid polimorfizmus, SNP) genotipzálás: SNP markerek olyan ismert DNS szekvenciák amikben egyetlen nukleotide változik, aminek következménye 4 allél kialakulása. Alkalmazás: pl SnaPshot multiplex rendszer (metiláció vizsgálat, különböző betegségeket okozó mutációk vizsgálata, stb).
- MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification)
Az MLPA vizsgálat során a génen belüli nagyobb deléciók és duplikációk vizsgálhatóak.
-
A triplet primed PCR a trinukleotid repeat betegségek vizsgálatára kifejlesztett specifikus vizsgálómódszer.
|
|